تازه ها در میکروب شناسی دامپزشکی

تازه ها در میکروب شناسی دامپزشکی

همسانه سازی، بیان و تخلیص پروتئین ESAT-6 از سویه AN5 مایکوباکتریوم بویس و ارزیابی ایمنی زایی دو پروتئین نوترکیب ESAT-6 و CFP-10 در خوکچه هندی

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان
تقی زهرائی صالحی 1
رضا عارف پژوهی 2
نادر مصوری 3
زهرا صالحی نجف آبادی 4
رامک یحیی رعیت 5
1 گروه میکروبیولوژی و ایمنی شناسی، دانشکده دامپزشکی،؛ دانشگاه تهران، تهران، ایران
2 ش تولید توبرکولین و مالئین، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی (تات)، کرج، ایران
3 بخش میکروب شناسی، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی (تات)، کرج، ایران
4 بخش بیوتکنولوژی موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، کرج -ایران
5 گروه میکروبیولوژی و ایمونولوژی، دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران، تهران، ایران
10.22034/nfvm.2026.560371.1303
چکیده
اساس تشخیص آلودگی گاوها به بیماری سل گاوی با عامل مایکوباکتریوم بویس، آزمون پوستی یا تست توبرکولین است اما وجود موارد مثبت کاذب در این آزمون پوستی بدلیل واکنش های متقاطع PPD تهیه شده از سویه AN5 مایکوباکتریوم بویس با سایر مایکوباکتریومها از معایب آن بشمار می آید که جهت رفع آن استفاده از پروتئین هایی با ویژگی بالاتر توصیه می گردد. یکی از اهداف این مطالعه نیز کلونینگ، بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب ESAT-6 بعنوان پادگن مهم مایکوباکتریوم بویس در سیستم پروکاریوتی و ارزیابی ایمنی زایی آن در خوکچه هندی بود. در این مطالعه ژن esat-6 که رمز کننده پروتئین ترشحی ESAT-6 است با استفاده از روش PCR تکثیر شد. سپس محصول PCR بدست آمده با دو آنزیم آندونوکلئاز EcoRI و HindIII هضم و در ناقل پلاسمیدی pET23a(+) کلون و پس از ترانسفورماسیون در اشریشیا کلی DH5α تکثیر گردید. به منظور بیان پروتئین نوترکیب ESAT-6، حامل فوق که دارای ژن همسانه سازی شده esat-6 بود به اشریشیا کلی بیانی BL21 منتقل شد. با روش تعیین توالی صحت همسانه سازی ژن ذکر شده مورد تایید قرار گرفت سپس پروتئین نوترکیب ESAT-6 طی عملیاتی با رزین نیکل تخلیص گردید و با روش وسترن بلاتینگ بیان پادگنی پروتئین آن با استفاده از پادتن های تک بنیانی اختصاصی تائید شد. نتایج تعیین توالی ژن در کنار وسترن بلاتینگ، حاکی از آن بود که این پروتئین نوترکیب بدست آمده به خوبی بیان و تخلیص شده و می توان از آن در آزمایشات چالش و آزمون های تشخیصی همانند پروتئین نوترکیبCFP-10 بهره جست.
کلیدواژه‌ها
پروتئین ESAT-6
مایکوباکتریوم بویس سویه AN5
ارزیابی ایمنی زایی ESAT-6 و CFP-10
موضوعات

عنوان مقاله English

Cloning, expression and purification of ESAT-6 protein from Mycobacterium bovis strain AN5 and evaluation of immunogenicity of two recombinant proteins ESAT-6 and CFP-10 in guinea pigs.

نویسندگان English

Taghi Zahraei Salehi 1
Reza Arefpajoohi 2
Nader Mosavari 3
Zahra Salehi Najafabadi 4
Ramak Yahyaraeyat 5
1 Department of Microbiology and Immunology, Faculty of veterinary medicine, University of Tehran, Tehran, Iran.
2 Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine,
3 Department of Research and Production of Tuberculin and Mallein, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research Education and Extension Organization, Karaj, Iran
4 Department of Biotechnology, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research Education and Extension Organization, Karaj, Iran
5 Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine,
چکیده English

The basis for diagnosing cattle tuberculosis is the skin test or tuberculin test. However, the presence of false positive cases in this skin test due to the occurrence of cross-reactions of PPD prepared from the AN5 strain of Mycobacterium bovis with other mycobacteria is considered one of its disadvantages, which is why the use of proteins with higher specificity is recommended to overcome it. One of the objectives of this study was to clone, express, and purify the recombinant ESAT-6 protein and evaluate its immunogenicity as an important antigen of Mycobacterium bovis in the prokaryotic system. In this study, the esat-6 gene encoding the secretory protein ESAT-6 was amplified using the polymerase chain reaction method. Then, the obtained PCR product was digested with two restriction endonuclease enzymes EcoRI and HindIII and then cloned in the plasmid vector pET23a(+) and amplified after transformation in Escherichia coli DH5α. In order to express the recombinant ESAT-6 protein, the above vector containing the cloned esat-6 gene was transferred to Escherichia coli expressing BL21. The correctness of the gene cloning was confirmed by sequencing. In the following study, the recombinant ESAT-6 protein was purified using nickel resin and its antigenic expression was confirmed by Western blotting using specific monoclonal antibodies. The results of gene sequencing along with Western blotting indicated that the obtained recombinant protein was well expressed and purified and could be used in challenge experiments and diagnostic tests like the recombinant CFP-10 protein.

کلیدواژه‌ها English

ESAT-6 protein
CFP-10 protein
Mycobacterium bovis
Mycobacterium tuberculosis complex
1-Forbes BA. Mycobacterial Taxonomy. J Clin Microbiol. 2017 Feb;55(2):380-383
2-Borham M, Oreiby A, El-Gedawy A, Hegazy Y, Khalifa HO, Al-Gaabary M ,et al. Review on Bovine Tuberculosis: An Emerging Disease Associated with Multidrug-Resistant Mycobacterium Species. Pathogens. 2022 Jun 21;11(7):715.

3-OIE Terrestrial manual (2017), Bovine tuberculosis, Chapter 2.4.7

4- Khairullah AR, Moses IB, Kusala MKJ, Tyasningsih W, Ayuti SR, Rantam FA, et al.  Unveiling insights into bovine tuberculosis: A comprehensive review. Open Vet J. 2024 Jun;14(6):1330-1344.
5- Rua-Domenech R, Goodchild A T, Vordermeier H M, Hewinson R G, Christiansen K H, Clifton-Hadley R S. Ante mortem diagnosis of tuberculosis in cattle: a review of the tuberculin tests, gamma-interferon assay and other ancillary diagnostic techniques. Res. Vet.Sci. 2006; 81: 190-210.
6- Yang H, Kruh-Garcia NA, Dobos KM. Purified protein derivatives of tuberculin--past, present, and future. FEMS Immunol Med Microbiol. 2012 Dec;66(3):273-80.
7- Arefpajoohi   R, Zahraei Salehi T, Mosavari N, Salehi Najafabadi Z,  YahyaRaeyat R.  Cloning and Expression of Virulent Protein CFP-10 from Mycobacterium bovis Strain AN5. J Vet Res. 2021; 76 (1): 124-132 [In Persian].
8- Fifis T, Corner L A, Rothel J S, Wood P R. Cellular and humoral immune responses of cattle to purified Mycobacterium bovis antigens. Scand J.Jmmunol . 1994; 39: 267-274.

 9-B.M.Buddle,A.R.McCarthy,T.J.Ryan,J.M.Pollock,H.M.Vordermeier,R.G.Hewinson, et al. Use of mycobacterial peptides and recombinant proteins for the diagnosis of bovine tuberculosis in skin test-positive cattle, The Veterinary Record. 2003;15:615-620.

10-Arefpajoohi   R, Zahraei Salehi T, Mosavari N, Salehi Najafabadi Z,  YahyaRaeyat R.  Cloning and Expression of Virulent Protein CFP-10 from Mycobacterium bovis Strain AN5. J Vet Res. 2021; 76 (1): 124-132[In Persian].

11- Arefpajoohi   R,  Uses of recombinant antigens ESAT-6 and CFP-10 from Mycobacterium bovis for diagnosis bovine tuberculosis. Faculty of Veterinary Med.,  University of  Tehran;  2019. [In Persian].
12- Mojgani  N, Babaie M , Shakibamehr N, Mohammad Taheri  M., Mosavari  N, Ghaempanah  A, et al. 'Purification and biological analysis of specific antigens (ESAT6/CFP10) from Mycobacterium tuberculosis', Iranian J of Vety Sci and Tec. 2020;. 12(2): 59-67.
13- Whelan AO, Clifford D, Upadhyay B, Breadon EL, McNair J, Hewinson GR, et al. Development of a skin test for bovine tuberculosis for differentiating infected from vaccinated animals. J Clin Microbiol. 2010; 48(9):3176-81.

14- Frigui W, Bottai D, Majlessi L, Monot M, Josselin E, Brodin P, et al. Control of M  tuberculosis ESAT-6 secretion and specific T cell recognition by PhoP. PLoS.Pathog. 2008; 4: e33.

15- Palmer M V, Waters W R, Thacker T C, Greenwald R, Esfandiari J, Lyashchenko K P. Effects of different tuberculin skin-testing regimens on gamma interferon and antibody responses in cattle experimentally infected with Mycobacterium bovis. Clin. Vaccine Immunol. 2006; 13: 387-394.
16-Van Soolingen, D., de Haas, P.E.W., Kremer, K. (2001). Restriction Fragment Length Polymorphism Typing of Mycobacteria. In: Parish, T., Stoker, N.G. (eds) Mycobacterium tuberculosis Protocols. Methods in Molecular Medicine,2001; vol 54. Humana Press.
17- Gopal GJ, Kumar A. Strategies for the production of recombinant protein in Escherichia coli. Protein J. 2013; 32(6):419-25.
18- Borham M, Oreiby A, El-Gedawy A, Hegazy Y, Khalifa HO, Al-Gaabary M, et al. Review on Bovine Tuberculosis: An Emerging Disease Associated with Multidrug-Resistant Mycobacterium Species. Pathogens. 2022; 21;11(7):715.
19- Mon ML, Moyano RD, Viale MN, Colombatti Olivieri MA, Gamietea IJ, Montenegro VN, et al.  Evaluation of cocktails with recombinant proteins of Mycobacterium bovis for a specific diagnosis of bovine tuberculosis. Biomed Res Int. 2014;2014:140829. doi: 10.1155/2014/140829.

20- Parlane NA, Chen S, Jones GJ, Vordermeier HM, Wedlock DN, Rehm BH, Buddle BM. Display of Antigens on Polyester Inclusions Lowers the Antigen Concentration Required for a Bovine Tuberculosis Skin Test. Clin Vaccine Immunol. 2015;  28;23(1):19-26. doi: 10.1128/CVI.00462-15.

 

21- Buddle BM, McCarthy AR, Ryan TJ, Pollock JM, Vordermeier HM, Hewinson et al. Use of mycobacterial peptides and recombinant proteins for the diagnosis of bovine tuberculosis in skin test-positive cattle, The Vet Rec. 2003;15:615-620.

22- Alito A, McNair J, Girvin RM, Zumarraga M, Bigi F, Pollock JM, Cataldi A. Identification of Mycobacterium bovis antigens by analysis of bovine T-cell responses after infection with a virulent strain. Braz J Med Biol Res. 2003; 36(11):1523-31.
23- Stavri H, Bucurenci N, Ulea I, Costache A, Popa L, Popa MI. Use of recombinant purified protein derivative (PPD) antigens as specific skin test for tuberculosis. Indian J Med Res. 2012;136(5):799-807.
تازه ها در میکروب شناسی دامپزشکی
دوره 9، شماره 1
بهار 1405
صفحه 30-48

  • تاریخ دریافت 01 آذر 1404
  • تاریخ پذیرش 23 اردیبهشت 1405